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Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 12619 (2023) Citer cet article

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Une stratégie pour lutter contre la résistance aux antimicrobiens consiste à découvrir de nouvelles classes d’antibiotiques. La plupart des antibiotiques interagissent à un moment donné avec la membrane bactérienne pour interférer avec son intégrité ou pour la traverser. Des outils fiables et efficaces pour déterminer la constante de dissociation pour la liaison membranaire (KD) et le coefficient de partage entre les phases aqueuse et membranaire (KP) sont donc des outils importants pour découvrir et optimiser les effets antimicrobiens. Nous démontrons ici que la thermophorèse à l’échelle microscopique (MST) peut être utilisée pour la mesure sans marquage du KD en utilisant la fluorescence intrinsèque du tryptophane et en supprimant ainsi le besoin de marquage chromophore. Comme preuve de principe, nous avons utilisé la méthode pour mesurer la liaison d'un ensemble de petits AMP cycliques à de grandes vésicules unilamellaires (LUV) et à deux types de nanodisques lipidiques assemblés par l'acide styrène maléique (SMA) et l'ammonium quaternaire SMA (SMA-QA). ). Les valeurs KD mesurées correspondent bien aux mesures correspondantes utilisant la résonance plasmonique de surface (SPR), reflétant également largement la concentration minimale d'inhibition (CMI) des AMP testés envers S. aureus et E. coli. Nous concluons que le MST est une méthode prometteuse pour la détection rapide et rentable des interactions peptide-lipide ou pour la cartographie des conditions d’échantillon en préparation d’études plus avancées qui reposent sur une préparation d’échantillons, un étiquetage et/ou un temps d’instrument coûteux.

Les peptides antimicrobiens (AMP) attirent de plus en plus l’attention en tant que source d’inspiration pour lutter contre la crise imminente de la résistance aux antimicrobiens, alors que la découverte de nouvelles classes d’antibiotiques est au point mort1. Les AMP sont une classe de peptides qui ont une activité antimicrobienne, bien qu’ils soient également connus pour posséder certaines propriétés antifongiques et anticancéreuses2,3. Ce sont généralement des peptides cationiques courts d’environ 12 à 50 acides aminés, avec généralement au moins 4 résidus requis pour l’activité4. Présents dans la plupart des organismes vivants, ils sont des composants naturels et indispensables des défenses immunitaires innées5,6,7,8. Actuellement, plus de 20 000 séquences peptidiques dotées de propriétés antimicrobiennes sont publiées dans des dépôts dédiés9,10,11,12,13, constituant ainsi un pool de candidats thérapeutiques potentiels. Le mode d'action antimicrobien de la plupart des AMP semble être de cibler l'intégrité et/ou le potentiel électrique de la bicouche membranaire, ou d'avoir de multiples cibles et combinaisons de modes d'action, ce qui rend la résistance plus difficile à développer et s'accompagne d'un effet antimicrobien. coût de remise en forme plus élevé à maintenir. À quelques exceptions près, cela contraste avec les antibiotiques traditionnels, qui ont généralement une cible bien définie. Un deuxième avantage des AMP est qu’il n’est pas nécessaire de traverser entièrement la membrane, les peptides actifs membranaires exerçant souvent leurs activités en perturbant, en perméabilisant ou en lysant la membrane bactérienne elle-même14,15.

L'affinité de l'AMP envers les membranes bactériennes est souvent décrite de deux manières : comme un événement de liaison qui peut être décrit via la constante de dissociation KD16 ; ou comme système biphasique, où l'interaction de l'AMP avec les lipides est considérée comme un partage entre une phase lipidique et une phase aqueuse, caractérisé par la constante de partage KP17. KD et KP sont donc des descripteurs utiles pour cribler des composés en fonction de leurs interactions avec la membrane bactérienne cible.

Les méthodes actuelles utilisées pour évaluer l’affinité lipidique souffrent généralement de plusieurs inconvénients. Ils peuvent ne pas être applicables à des liaisons plus fortes (RMN)18, nécessiter un étiquetage ayant un impact sur la liaison (essais par fluorescence)19, prendre beaucoup de temps (RMN et SPR)20,21, exiger de grandes quantités d'échantillons (RMN) ou nécessiter un réglage fin. pour chaque composé individuel (SPR et ITC)20,21. La thermophorèse microscopique (MST) est une méthode qui ne présente pas ces inconvénients22. Il s'agit d'un outil simple mais puissant, qui permet la détermination des paramètres de liaison par observation des effets de liaison sur un fluorophore et sur les propriétés thermophorétiques relatives des complexes formés. Les liaisons sont obtenues en surveillant les modifications de l'intensité de fluorescence d'un complexe au fil du temps lors de l'exposition à un laser IR. Le laser chauffe une série d'échantillons avec des concentrations de ligand différentes, provoquant une redistribution des molécules en fonction de leurs énergies Gibbs relatives en solution aux différentes températures (thermophorèse). Les changements de fluorescence dus aux effets de liaison du ligand sont surveillés lors du chauffage et du refroidissement. La méthode est sensible aux changements de pli, de forme, de coque de solvatation, de charge ou de taille globale du complexe lié au ligand. Ces changements peuvent affecter l'environnement local d'un fluorophore en modifiant la trempe dynamique et statique, ainsi que les propriétés thermophorétiques du complexe, et rendre le MST sensible à des changements potentiellement mineurs dans les propriétés résultant de la liaison . La MST est actuellement principalement utilisée pour évaluer les interactions biomoléculaires, notamment la liaison de ligands à divers substrats22 et la polymérisation24. Une application précédente connexe du MST par Yu et al. évalué la liaison d'un AMP à l'aide du marquage FITC25. Le MST peut être réalisé à l'aide d'un marquage au fluorophore ou sans marquage, en tirant parti des acides aminés intrinsèquement fluorescents comme W, Y et F. La quasi-ubiquité de W dans de nombreux AMP offre la possibilité d'étudier directement les propriétés de liaison de l'AMP en utilisant la fluorescence intrinsèque de W. Les autres avantages importants du MST sont les faibles besoins en échantillons, les temps de mesure courts et la configuration expérimentale simple20,21,26.